Science︱基于液滴微流控正向遗传筛查星胶-小胶的相互作用基因

撰文︱Jane Cheng

责编︱王思珍，方以一

大脑内胶质细胞之间的相互作用异常会导致神经疾病，如多发性硬化症（MS）及其自身免疫性脑脊髓炎（EAE）[1]。 表征星形胶质细胞-小胶质细胞相互作用是重要的治疗靶点之一。然而，目前的方法并不能直接反映细胞互作与分子水平变化的相关性，并且难以检测由表面或分泌因子介导瞬时的细胞互作，因此检测方法亟需改进。

正向遗传筛选平台，例如基于CRISPR-Cas9系统的平台[2]，虽然是鉴定基因的强大工具，但无法进行高通量共培养和受干扰单细胞的筛选，限制了它们在研究细胞互作中的应用。用于研究细胞互作的正向遗传筛选平台需要能够在受控微环境中建立由表面或分泌因子介导的细胞互作，同时需要能够检测由这些互作产生的现象，并确定这些变化是否由特定CRISPR-Cas9诱导。

2023年3月10日，来自哈佛医学院的Francisco J. Quintana团队在Science上发表了题为“Droplet-based forward genetic screening of astrocyte–microglia cross-talk”的文章，展示了一项名为SPEAC-seq（systematic perturbation of encapsulated associated cells followed by sequencing）的高通量平台，可以用于细胞互作间的正向遗传筛查。

研究人员首先将两种细胞用微流体进行共封包形成油包液滴并在试管中共培养（图 1A），经三色光学器件（图 1B）和介电泳微流控分选仪（图 1C）筛选出成功封包细胞对的液滴，用于后续细胞互作的研究。随后使用具有细胞渗透性的荧光染料进行多重标记，用于加样（图 1D）和检测（图 1E）液滴中的细胞对。图1F显示了优化液滴分选参数后，分离出的报告基因激活的细胞对，初步检测到与激活的巨噬细胞配对的NF-kB标记的星形胶质细胞中，EGFP表达的上调。以上说明研究人员成功建立了基于油包液滴的共培养体系。

图 1. 皮升液滴容器中细胞间相互作用的检测平台示意图。(A) 通过在皮升油包水液滴内使用微流体将细胞共包封；(B) 使用三色定制液滴细胞计数系统根据荧光监测共培养细胞对；(C) 用介电泳分选以分离细胞对。FPGA，现场可编程门阵列；PMT，光电倍增管。(D) 在液滴内共培养的细胞与邻近的细胞对保持隔离，并通过直接接触和/或分泌的可溶性因子相互作用。(E) 显示液滴（PMT3，低持续强度）、细胞 2（PMT 3，尖峰强度峰）、EGFP报告基因（PMT1）和细胞1（PMT2）存在的液滴细胞计数时间跟踪数据。添加惰性CY5示踪染料以检测正确大小的液滴。右图显示细胞对可能对应的荧光组合。(F) 分选细胞对策略，分选液滴需要符合 (i) 大小正确，(ii) 包含一个激活的报告细胞（星形胶质细胞），以及(iii)与所需的细胞对（星形胶质细胞-小胶质细胞）。

（图源：Wheeler MA, et al., Science, 2023）

接下来，研究人员将基于液滴的共培养系统与CRISPR-Cas9干扰技术相结合，建立了SPEAC-seq，用于检测细胞互作的正向遗传筛选，并将其应用于鉴定参与抑制星形胶质细胞中NF-kB激活的小胶质细胞分泌的细胞因子。研究人员使用全基因组CRISPR-Cas9文库转导原代小鼠小胶质细胞，并使用嘌呤霉素筛选出稳定转导的小胶质细胞（图 2A），并将其与NF-kB报告的星形胶质细胞（图2B）共封装24小时，然后分选含有由小胶质细胞和EGFP+星形胶质细胞组成的活细胞对的液滴（图 2D）。通过基因组DNA聚合酶链反应（PCR）扩增和深度测序从少量分选的液滴中分选出了稳定掺入小胶质细胞基因组DNA的单向导RNA（sgRNA） 序列（图 2E），用于分析针小胶质细胞中负调节星形胶质细胞NF-kB因子的sgRNA，最终得到了1061个候选分子的列表（图 2F）。对正液滴分数的分析发现了已知的NF-kB信号转导负调节因子，包括异生物质代谢、核受体激活和NRF2信号转导，分选到的液滴数量和检测到的引导RNA序列的数量高度一致（图 2F）。图2G显示了用生信分析发现了SPEAC-seq检测到的抑制星形胶质细胞NF-kB激活的途径。

图 2. SPEAC-seq 鉴定小胶质细胞中抑制星形胶质细胞促炎反应的因子。 (A)从野生型 (WT) B6小鼠中分离小胶质细胞，并通过Low-MOI spinfection全基因组慢病毒 CRISPR-Cas9 文库（78,637 sgRNA 序列）进行转导，在每个细胞中产生单个突变。 (B-D) 从 p65EGFP 报告小鼠中分离出星形胶质细胞，并与（A）中的小胶质细胞在液滴中共培养24小时。使用高通量微流体荧光激活细胞分选平台筛选细胞对。 (E) 细胞对的液滴分选、基因组 DNA 提取和通过 PCR恢复的sgRNA用于生成用于Illumina测序的文库。(F) 分析从含有 EGFP+星形胶质细胞（中）的分选液滴中检测到的小胶质细胞基因组导向DNA的sgRNA。（G）生信分析发现的SPEAC-seq检测到的抑制星形胶质细胞NF-kB激活的途径。

（图源：Wheeler MA, et al., Science, 2023）

为了进一步评估SPEAC-seq发现的每个候选通路在炎症环境下的调节作用，研究人员应用了一种细胞类型特异性的体内Perturb-seq方法。研究人员设计了慢病毒载体共表达四种sgRNA，这些sgRNA靶向星胶特异的Cas9开放阅读框中的barcodes（图 3A），分别对应Egfr、Gfra2、Lag3、Oprl1这四种星胶受体。小鼠EAE造模后，用流式分选出EGFP阳性的星胶胶质细胞进行SPEAC-seq检测。结果显示，表达 Egfr、Gfra2、Lag3或Oprl1的sgRNA的星形胶质细胞NF-kB转录激活增加（图 3C），Egfr靶向导致IL-1b/TNFa信号通路的激活最强，从而促进NF-kB转导的与EAE和MS相关的星形胶质细胞反应。双调蛋白（Amphiregulin）可在中风期间导致外周和中枢神经系统的炎症，这表明它是在对创伤和/或炎症的反应中被诱导产生的。确实，EAE诱导后17天检测到小胶质细胞中Areg表达增加（图 3E）。与SPEAC-seq数据一致，Egfr在星形胶质细胞中的表达水平高于在小胶质细胞中的表达水平（图 3E）。以上结果说明了在EAE模型中，小胶质细胞分泌的 AREG 通过星胶 EGFR 受体抑制星胶的促炎反应。

图 3. 小胶质细胞分泌的AREG抑制星形胶质细胞促炎反应。(A) 构建barcode慢病毒库，用于候选星形胶质细胞受体的体内Perturb-seq分析。(B) 4只EAE小鼠中捕获的星形胶质细胞的UMAP 图。(C) 敲低目标星形胶质细胞受体后，NF-kB 信号通路的分析。 (D) Qiagen IPA网络分析表明EGFR信号抑制了TNFa和IL-1b驱动的NF-kB 信号。 (E) qPCR 确定Egfr和Areg在星胶和小胶中的表达。

（图源：Wheeler MA, et al., Science, 2023）

最后，研究人员想探索EAE期间，什么病理因素可诱导小胶质细胞Areg的表达。已有研究表明IL-33是EAE的抑制剂，Areg表达的诱导剂[3]。IL-33是组织损伤后细胞释放的一种警报素[4]。为了确定IL-33是否调节AREG介导的小胶质细胞-星形胶质细胞互作，研究人员首先重新分析了RABID-seq数据集，并确定了在EAE峰值期间与 Areg+和Areg- 小胶质细胞相关的小胶质细胞-星形胶质细胞相互作用，提示了EAE 期间星胶分泌的IL-33信号是调节Areg+小胶质细胞的上游因子（图 4A）。为了验证这种RABID-seq预测，研究人员在体外用重组IL-33刺激原代小胶质细胞，检测到小胶质细胞Areg/AREG表达增加（图4B &C）。这些发现表明星胶产生的IL-33诱导的小胶表达Areg，然后抑制星胶的促炎作用这样的一个负反馈调节。接着研究人员利用Cx3cr1::CreERT2;Il1rl1(f/f) 转基因小鼠进行了在体实验。用他莫昔芬抑制Cx3cr1::CreERT2;Il1rl1(f/f) 小鼠小胶质细胞Il1rl1表达，一个月后通过用MOG主动免疫诱导 EAE。与体外数据一致，小胶质细胞中的缺失导致EAE恶化（图 4D），并伴随着小胶质细胞Areg表达降低以及星形胶质细胞小胶质细胞中促炎反应增加。

图 4. IL-33-ST2 信号通路控制星形胶质细胞-小胶质细胞互作。 (A) EAE恶化期间IL-33调节Areg+小胶质细胞与Egfr+星形胶质细胞的相互作用。(B 和 C) IL-33 诱导原代小胶质细胞 Areg/AREG的表达。(D) 条件性ST2敲除的 EAE 曲线。

（图源：Wheeler MA, et al., Science, 2023）

此外，研究人员还在MS患者病变中检测到IL33+GFAP+细胞增加（图 5K），AREG+小胶质细胞增加（图 5L），小胶质细胞ST2（IL-33 受体）介导的丝裂原活化蛋白激酶信号增加，以上结果表明了星胶来源的IL-33可促进ST2+小胶细胞中AREG的表达。

图 5（K）免疫染色检测 MS 患者CNS样本中的IL33+星形胶质细胞。NAWM（外观正常的白质）；WM（白质）。(L) 免疫染色检测MS患者CNS样本中的AREG+ 小胶质细胞。

（图源：Wheeler MA, et al., Science, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

简单来说，本文基于微流体、液滴中的细胞共培养、CRISPR-Cas9遗传干扰和液滴分选的平台建立了可以用于检测细胞互作的SPEAC-seq平台，它能够进行正向遗传筛选以识别细胞通讯机制，并使用SPEAC-seq，确定了一个由小胶质细胞-星形胶质细胞相互作用驱动的调节负反馈回路，该相互作用由双调蛋白和IL33-ST2信号介导，抑制了星形胶质细胞NF-kB驱动的炎症反应，可能是导致EAE和MS的原因之一。SPEAC-seq可以与表观基因组或转录组的全基因组分析相结合，以研究它们通过细胞间相互作用的调控，或与抗体或小分子barcode文库，用于识别细胞间通讯的治疗靶点。 此外，SPEAC-seq还可以结合其他类型的CRISPR-Cas9编辑，例如针对相互作用细胞的表观遗传状态、转录激活或抑制或RNA编辑的扰动，具有广阔的应用空间。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abq4822

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参考文献（上下滑动查看）  

1. Han, R.T. et al. (2021) Astrocyte-immune cell interactions in physiology and pathology. Immunity 54, 211-224. 10.1016/j.immuni.2021.01.013

2. Yin, H. et al. (2019) CRISPR-Cas: a tool for cancer research and therapeutics. Nat Rev Clin Oncol 16, 281-295. 10.1038/s41571-019-0166-8

3. Ito, M. et al. (2019) Brain regulatory T cells suppress astrogliosis and potentiate neurological recovery. Nature 565, 246-250. 10.1038/s41586-018-0824-5

4. Yang, D. et al. (2017) Alarmins and immunity. Immunol Rev 280, 41-56. 10.1111/imr.12577

编辑︱王思珍

本文完